病原菌的结构_群落包不包括微生物

撰文：文涛 南京农业大学

责编：刘永鑫 中科院遗传发育所

全文约1.6万字，读完需20分钟。

主编按：本文被评为ISME 2018年编辑部推荐最佳文章，同时被Nature出版集团精选为ISME和Nature Microbiology精选文章。1年引用了32次，是ISME自身影响因子水平的3倍多。强烈推荐阅读！

病原菌介导植物根际有益微生物群落组装

Disease-induced assemblage of a plant-beneficial bacterial consortium

The ISME Journal, [9.504]

https://doi.org/10.1038/s41396-018-0093-1

Published online 08 March 2018

第一作者：Roeland L. Berendsen and Berendsen, Gilles
Vismans¹

通讯作者：Roeland L. Berendsen¹ r.l.berendsen@uu.nl

合作作者： Ke Yu¹ Yang Song^1,2 Ronnie de Jonge^1,3,4 ● Wilco P. Burgman¹
Mette Burmølle ⁵ Jakob Herschend⁵ Peter A. H. M. Bakker¹ Corné M. J. Pieterse ¹

主要单位：

• ¹ 植物微生物互作中心, 环境生态所, 乌特勒支大学, Padualaan 8, 3584 CH Utrecht, 荷兰
• ² 江苏省固体废弃物协同研究中心, 南京农业大学, 南京 , 中华人民共和国

划重点

1. 病原菌入侵通过激活植物系统诱导抗性（ISR）富集特异性的根际有益菌，这些有益菌相互合作并作为一个整体，共同参与抵抗植物病原菌。
2. 上一代受到病原菌入侵的植株将遗产留在土壤中，协助下一代植株抵御同种病原菌的入侵。（此处翻译为：土壤遗产；相似性概念也称之为：土壤记忆）

译者有话说

1. 作者首先关注病原菌入侵下，植物同土壤微生物的相互作用，在目前高通量测序盛行的年代，通过测序很容易得到根际微生物群落的整体特征，但是在求全的理念下必然丧失对细部的掌控，所以PhyloChip的使用表明了作者的良苦用心。这一技术的分辨率更高（会丧失群落整体特征），对于后续筛菌试验，会更加有力的整合筛菌结果。毕竟测序仅仅只是发现一个现象，对于验证部分的工作才是研究的重点.
2. 在我翻译本文的时候，过长的材料方法值得尊敬，所以我逐字翻译材料方法，希望更好为大家展示一个根际互作方面研究的一个成功案例。本文的故事线非常立体，内容很是丰富，在根际互作方面我认为是一个范本。通过PhyloChip明确特征菌差异，多种培养基组合特异性筛菌得到候选细菌，box-PCR和细菌基因组用于鉴定菌株特异性，平板组合对峙和纯菌回接拟南芥试验用于验证菌株功能。根据现象提出土壤遗产假设，并验证假设。
   但是本文在土壤遗产部分，做的工作并不多，这个有意思的现象值得我们去深入探索，比如在土壤遗产的被激活过程；遗产可以持续多长时间；生物胁迫和非生物胁迫是否都会形成土壤遗产，各自形成遗产的是否不同；土壤遗产帮助抵御病害，但是同农业其他措施的对比，是否具有优势等。
   这篇文章同之前翻译的《Microbiome：根系分泌物驱动土壤记忆抵御植物病原菌》内容有很大关联，如果大家有兴趣可以放在一起阅读。

摘要

通常在植物病害多次爆发后，会形成抑病土壤。特定有益微生物会在后代植株根际富集。就植物对根际招募有益微生物影响而言，我们知之甚少。在本研究中，我们证明了受霜霉病的病原菌侵染后，拟南芥的叶面防御系统被激活，并在根际特异性地富集了三株细菌。随后分离得到的这三株有益菌，发现在试验条件下它们可以协同促进生物膜形成。不同于单种细菌的是，多种细菌组合可诱发植株对霜霉病的系统性抗性，并促进植株的生长。此外，本研究发现经历病原菌感染后的一代作物通过土壤帮助下一代植株抵抗霜霉病病原菌，形成土壤遗产。总之，本研究结果表明，植株受到病原体感染，通过调整根际微生物群落，招募了一批有益菌群协助植株抵抗病害并促进植株生长。这一作用通过土壤为媒介，为后代植株增强在病原菌侵染下存活概率。

引言

由于土壤的负反馈，连坐植株在自身周围的土壤中积累病原菌，并对植株的生长造成负面影响。自然界，土壤负反馈可以通过调节优势植株促进植物的生物多样性。但农业生态系统中，尤其是连坐体系中这种土壤病原体的积累方式可能是毁灭性的，虽然通过轮作可以部分缓解。有趣的是，一些重要农作物，像小麦和甜菜的连坐可以诱导抑病型土壤。在这种特异性的抑病型土壤中，尽管存在致病性的病原体，但植物仍然保持健康。其抑病性产生的原因：

1）特定的有益微生物群体抑制病原菌生长和活性；

2）抑制病原菌生长的抗生素类化合物的产生；

3）通过有益根际微生物来刺激宿主免疫系统，被称为诱导系统性抗性(ISR)，也可能有助于抑制病害。

这第三条正是本文重点关注的地方。

通常在作物连坐病害爆发后，土壤中抑病性增强，表明在受到病原菌攻击时，植物会富集有益微生物。其次植物可以调控并促进有益的根际过程。与抗逆相关的植物激素水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)调控拟南芥招募根际微生物群落。SA和JA这两种激素是植物免疫信号网络的主要调节因子。SA响应并抵御寄生式病原真菌的入侵，而JA一般响应并抵御营腐生病原菌入侵。由于SA或JA对寄生式病原真菌（biotrophic pathogens）或腐生病原真菌（necrotrophic pathogens）入侵时的响应不同，导致对根际微生物群落的组装影响不同，所以我们假设这些生活方式截然不同的病原菌的入侵必然导致不同的根际微生物类群的富集。

备注：

• 寄生式病原真菌： 从活细胞中获取能量，它们存在于活植物上或活植物中，可以具有非常复杂的营养需求并且不会迅速杀死宿主植物;
• 腐生病原真菌： 病原菌从死细胞中获取能量; 它们迅速侵入并杀死植物组织，然后在死亡的残骸上进行生物腐蚀;
• 半腐生病原真菌： 有一个初期的生物寄生，然后是腐生。

为了验证这一假设，我们在荷兰Reijerscamp的一处适合拟南芥生长的天然农田采集土壤并设计盆栽试验。将5周龄拟南芥植物用于设置如下处理：1）寄生式病原真菌Hyaloperonospora arabidopsidis接种；2）腐生病原真菌 Botrytis cinerea 接种；3）用1mM SA（模拟寄生式病原真菌入侵后的激素反应）喷施叶面；4）100μM MeJA（MeJA，模拟腐生病原真菌入侵后的激素反应）喷施叶面；5）对照。明确在不同的叶片防御体系下关键的根际细菌和古菌微生物类群的响应,相应处理后培养的一周和两周后分别从根际和土体土壤提取DNA, 并使用PhyloChip测定微生物群落特征。随后，我们分离鉴定了根际细菌，并研究了菌株对植株有益的生物学相关特性。

结果

免疫刺激植物根系微生物群的变化

Root microbiome changes on immune-stimulated plants

为了研究叶片病原菌感染、SA、MeJA处理对根际微生物群落结构的影响，我们对ISR激活后2周内的微生物群落变化进行了监测。Phylochip结果显示，共有341个eOTUs，其中大部分属于变形门杆菌(43%)、厚壁菌门(20%)和拟杆菌门(20%)。为了确定样本间eOTUs丰度变化的关键驱动因素，我们使用了主成分分析PCA(图1a)。第一主成分(PC1)将未种植的土壤样品于根际样品中分离开来，表明了拟南芥的根际效应，其中特定的微生物在根际比在土体土壤中更多。第二主成分(PC2)在明显将Hpa感染植物的根际与其他处理根际微生物群落区分。大多数eOTUs与PC1相关，无论这些eOTU再根际增加或是减少(图1b;图S2)。只有三个eOTUs与PC2有很强的关系(图1b)。这三个eOTU分别为eOTU 97、eOTU 106和eOTU 107。与未接种病原菌的植株相比，无论再接种病原菌后的第1周还是第2周，感染Hpa的植株的根际中这三个eOTU的含量明显更高(图1c e)。这些eOTUs分别被注释为黄单胞菌(Xanthomonas)、微杆菌（Microbacterium）和寡养单胞菌(Stenotrophomonas)。此外，水杨酸处理后一周或者两周，这三个eOTU中者至少在一个时间点丰度会提高，虽然并没有Hpa组丰度高(图1c e)。无论是在处理后的一周还是两周，Bc侵染组和添加茉莉酸组中eOTU107和eOTU97至少有一个的丰度会显著增加,这表明这些eOTUs的丰度的提高与植物根际防御的激活有关,尤其植株受到Hpa病原菌感染。

Hpa在感染植株后7天内形成了厚垣孢子(heavy sporulation)，并在叶片中引发依赖于水杨酸的防御反应，表现为与水杨酸反应相关的标靶基因(PR-1)强烈的被诱导表达(图S4A)。SA处理也可诱导PR-1含量上升，但低于Hpa感染组；Bc感染和MeJA处理也可以检测PR-1表达量轻微上调。这些结果表明，观察到的根际eOTUs 97、106和107的丰度增加与水杨酸途径密切相关。虽然Bc侵染或者茉莉酸处理会导致茉莉酸途径的标靶基因PLANT DEFENSIN1.2
(PDF1.2) 和 VEGETATIVE STORAGE PROTEIN2
(VSP2)上调，但是我们并没有观察到这些现象是由微生物介导的。

图1. 拟南芥感染霜霉病后根际富集特定微生物

Fig. 1 Downy mildew infection promotes growth of specific microbiota in the rhizosphere of Arabidopsis.

1A. 不同病原菌入侵和激素模拟处理微生物群落PCA分析，结果表明霜霉病的病原菌入侵改变了拟南芥根际微生物群落组成。

1B. PCA loading图表明：大多数eOTUs与PC1相关，但是三个eOTUs（97,106,107）与PC2有很强的关系，表明了这三株菌可能响应病原菌Hpa入侵。

1C-1E. 三个目标eOTU在接种霜霉病病原菌Hpa一周后丰度上升，两周后丰度更高，表明了这三个eOTU响应病原菌Hpa入侵，并随时间逐渐丰度逐渐提升。

Hpa感染植物根际微生物的特征

Characterization of recruited rhizosphere microbes of Hpa-infected plants

为了进一步探索eOTUs97、106和107的特征，我们针对性的筛选了一些候选eOTU的菌株。我们使用细菌培养基或者这三种菌（Xanthomonas, Stenotrophomonas,
Microbacterium）的选择性培养基，挑选出来279个单菌落。基于16S rRNA基因扩增测序，这279个单菌落分属于35个属，当然包括我们这三个eOTU所在的三个属:Xanthomonas属得到三株、Stenotrophomonas,属得到一株、
Microbacterium属得到三株。使用BOX-PCR技术鉴定Xanthomonas和Microbacterium属中的三株菌，结果在补充材料中。探针群同样检测和这三株菌的16
S rRNA，发现结果与上文中挑选得到的三个eOTU相同。表明了作者可能筛选到了这些OTU对应的活菌。
由于对Xanthomonas, Stenotrophomonas,
Microbacterium的几株菌进行The 16S rRNA 基因鉴定并不能到种水平，所以我们对这几株菌进行了基因组的测定。Xanthomonas sp. WCS2014-23, Stenotrophomonas sp.
WCS2014-113 和* Microbacterium* sp. WCS2014-259这三株菌的基因组分别进行参考基因组比对，同样鉴定到了属水平。Average nucleotide identity (ANI)指标介于94到96%之间可以被定义为同一个种。基于ANI指标，作者在数据库中寻找与Xanthomonas sp. WCS2014-23最相似的参考基因组为Xanthomonas sp. Leaf148 (97.5% ANI)，这种菌来自在拟南芥叶片。其余全部属于Xanthomonas 的菌株菌的ANI值均在91.5%以下。表明了WCS2014-23可能属于未知的种，或者未进行基因组测序。与Stenotrophomonas
sp. WCS2014-113 最为相似的菌是 Stenotrophomonas
maltophilia strain AA1 (94.5% ANI)，分离自玉米根际。于此同时，Stenotrophomonas
maltophilia type strain NBRC 14161 的ANI为
90.5%表明了这株菌不属于Stenotrophomonas
maltophilia。表明了可能这也是一株新菌或者也未进行基因组测序。同样与Microbacterium sp. WCS2014-259
w最为相似的是 Microbacterium foliorum strain 122, 一种植物内生菌分类自鸭茅（Dactylis glomerata），ANI 为 88.8%，表明了数据库中没有与目标菌株相似的菌。总之，我们的三株菌最后并没有注释到种水平，但是与这几株菌类似的多株菌存在于别的作物根际。

植物招募的根际微生物有益于植物

Plant-beneficial effects of recruited rhizosphere microbes

受病原菌入侵影响的植株同时招募这三个eOTUs，表明它们可能与根际存在密切的联系。我们知道植物根表可形成生物膜，这些参与生物膜形成并定殖于根际的细菌参与多种根际微生物学过程，如植物生长调节剂、防御诱导剂和抗生素的分泌，这些活动可能影响宿主和附近其他的微生物活动。本研究在试验条件下进行生物膜形成实验，发现三株细菌在生物膜形成过程中的协同作用，表现为三株细菌在根际共同形成生物膜的量大于各自单独形成的生物膜(图2A)，这表明在叶片组织遭受病原菌Hpa感染后，这三株细菌在拟南芥根际协同抗病。在实验条件下三株菌株在平板上相互吸引也佐证了这一观点(图2b;图S7)。分离的寡养单胞菌对黄单胞菌和微杆菌均有促进菌落生长的作用。同样黄单胞菌的生长也受到附近其他两株菌的影响。

为了明确这三株细菌联合体对植株生物学相关特性的影响，本研究将拟南芥种植在预混三株菌单菌或者三株菌混合物的基质中，并在接种病原菌后测试这些菌株或组合对诱导ISR过程的影响。假单胞菌WCS417r是被多次研究过的一种根际有益菌，其在植株根际定殖并诱导了植株系统抗性。因此本实验中使用WCS417r作为对照，并验证了在病原菌侵染拟南芥叶片后，由于根际WCS417r的作用，诱导了拟南芥ISR过程并减少了霜霉病病原菌孢子的产量(图3A)。以上实验也表明本研究中单独的三株菌对病原菌孢子产量没有影响(图3A)，但是三株菌的混合却显著的降低了拟南芥叶片病原菌孢子产量。总之，病原菌感染拟南芥后，其根际大量招募Xanthomonas, Stenotrophomonas,
和 Microbacterium isolates，通过诱导植物ISR增强植株的抗病水平。这一结果支持“根际微生物作为一个整体保护植株”这样的观点。

植株对病原菌的直接抵抗会增加植株整体抗病水平，但是这是以一定的消耗为代价的，所带来的影响包括植株生长变得缓慢，结实率减低等。然而，在植株同样受到病原菌侵染时，模式菌株WCS417通过诱导植株ISR过程，似乎降低了植株感染病原菌后的消耗。为了证实以上三株菌是否存在这一现象，在病原菌入侵条件下，测试本研究筛选得到的三株菌和模式菌株WCS417对植株生长生物学指标的影响。当然结果表明了这四株菌均未对植株的地上部鲜重造成负面影响(图3B)，并且本研究得到的三株菌混合物显著的增加了拟南芥地上部鲜重(图3B,C)。

图2. 分离的三株细菌间的相互作用

Fig. 2 Synergistic interactions between recruited Xanthomonas, Stenotrophomonas, and Microbacterium spp. strains

2A. Xanthomonas WCS2014-23(X;eOTU 106)，Stenotrophomonas sp. WCS2014-113 (S; eOTU 97) 和 Microbacterium sp. WCS2014-259 (M; eOTU 107)这三株菌及其组合生物膜形成定量试验表明三株菌共同促进了生物膜形成.

2B. Microbacterium sp. WCS2014-259菌株受其他两株菌吸引。

图3. 分离的三株细菌对拟南芥植株生长和抵抗病原菌的协同作用

Fig. 3 Synergistic effects of recruited rhizobacteria on systemic immunity against Hpa and plant growth promotion

3A. Pseudomonas simiae WCS417和 S,X,M的三株菌混合(XSM)显著降低拟南芥叶片的Hpa的产孢数量。

3B. 接种三株有益菌或者Pseudomonas simiae在病原菌Hpa入侵的情况下并不影响植株地上部鲜重，而分离得到的三株菌组合反而提高了植株地上部鲜重。

3C. 病原菌Hpa入侵后，对照和接种三株菌株混合液的拟南芥生长照片表明了处理组生长状况更好。

病原菌介导的土壤遗产保护后代植株

Soil-mediated legacy of Hpa-infected plants protects a successive plant population

ISR的激活可以使植株对未知病原体或昆虫的入侵提前做好准备并有益于植株抗逆，但是ISR作用不太可能挽救一个已经被Hpa感染的植株。因此我们假设，在受到病原体攻击时，将有益的微生物招募到根际有利于在后代植株生长。为了验证这一假设，我们种植一代拟南芥，并且接种病原菌。除去第一代植株后，连坐第二代拟南芥，并用Hpa对其进行处理(图4)。研究设置对照处为未种植第一代植株，其他操作同处理组，对照处理病原菌接种使用无菌水作为替代。结果表明生长在受霜霉病预处理的土壤中的第二代的拟南芥幼苗比生长在对照处理土壤中更能抵抗霜霉病病原菌的感染(图4B)。验证假设叶面霜霉病感染会导致土壤遗产的形成，从而使后代作物对霜霉病感染更具抵抗力。

图4. Hap感染植物的土壤在下代帮助抗病

Fig. 4 Soil-mediated effects of Hpa-infected plants on disease resistance in a subsequent population of plants.

4A. 展示土壤遗产试验设计：连作两季拟南芥，并且使用无菌水和病原菌分别接种土壤和植株，一共得到八个处理，第二季这八组处理均在拟南芥叶片接种病原菌，检测发病率。

4B. 发病率检测结果表明了，第一季拟南芥叶片感染病原菌后连坐第二季拟南芥植株发病率更低，表明了遭受病原菌感染后形成土壤遗产并帮助连坐植株抵御病害。

结论

拟南芥叶片受到霜霉病感染后，富集了根际有益菌Xanthomonas, Stenotrophomonas,
和 Microbacterium isolates。表明了受营寄生型病原菌感染的拟南芥植物后，促进了其根际特定微生物类群的富集并帮助植株抵抗逆境。对小麦和胡椒植物的类似研究同样支持相似的观点。

有趣的是， Stenotrophomonas也是少数几个因白粉虫入侵辣椒叶组织而在辣椒表上大量富集的属之一。这表明多种植物防御系统激活后Stenotrophomonas属均能得到富集。与Hpa入侵相比，灰霉病病原菌Botrytis cinerea的感染在地上部植物组织中显著诱导了水杨酸途径marker基因PDF1.2的表达，但这并没有明显促进根际微生物的生长。这表明不同的叶病原菌对根际微生物的影响不同。以上结果将更好的理解植物在病原菌入侵时其根际招募有益菌的遗传基础，有利于更好的在植物防御过程中调动根际微生物的作用并增强控制作物病害的能力，甚至解锁新的育种策略。

在本研究中，作者使用PhyloChip来分析根际的微生物群落组成。PhyloChip技术可以更灵敏地检测微生物物种丰度的差异并且比测序具有更高的重现性。然而，系统芯片不能准确估计一个分类单元在整个群落中所占的比例。因此，在我们的实验中，很难评估所招募到的Xanthomonas, Stenotrophomonas, 和 Microbacterium isolates的实际数量。后续试验表明，诱导植物ISR反应需要至少10⁵ CFU/g的 Stenotrophomonas。无论如何，可以诱导ISR的菌株不太可能治愈已经感染植株。因此，作者验证了一种假设，即在受到病原体叶面感染时，根际微生物群落的富集有利于后代植物的抗病。并证明了在第一批植物中霜霉病的感染确实产生了一种土壤记忆效应或者土壤遗产，并对后代植株抵抗同种病原菌提供了帮助。虽然我们不能排除植物产生的化学物质的直接影响（根系分泌物），但这种遗传效应很可能源于微生物的作用。结论，植株叶片遭受病原菌感染导致有益的特定根际微生物类群的富集，这些有益微生物类群有助于保护后代植株抵御同种病原菌入侵。

材料方法

Materials and methods

土壤及预处理

Soil and soil preparation

土壤于2012年4月取自荷兰Reijerscamp自然保护区（52°01′02.55″, 5°77′99.83″)。在该地区自然生长大量的本地拟南芥种群。这片土地经今被用于农作物生产超过60年，直到2000年弃耕，之后，被散养放牧牛和鹿，期间定期清除木本植物的幼苗(野外实验，要介绍实验用地的种植历史，一般还要测土壤理化性质)。土壤厚度为30 ~ 50厘米。表层土壤组成包括：88%的沙子、8%的淤泥、2%的粘土和2.3%的有机质，C/N比：24(pH 5.4下，测定于荷兰瓦赫宁根土壤化学分析实验室)。收集表层20厘米的土壤，风干过筛(3毫米筛)，去除植物碎屑和岩石，然后在室温下保存。为了在实验前恢复微生物群落活性，将土壤铺至5厘米厚，浇水至饱和，并种植拟南芥，等待幼苗在土壤上生长3周后将土壤中植株去除并将土壤过筛。保存在4℃，并于2周内开展实验。

植物生长条件

Plant growth conditions

将拟南芥（Col-0）播种在灭菌河砂（Hubun Inc.，荷兰）中，并浇灌改良的½ Hoagland溶液至饱和，放置于4°C黑暗中孵育2天。然后转移到光照培养箱内培养(21°C；相对湿度70%；10 h光照/14 h黑暗；光强度100 μmol H^-2 s^-1 )。两周后，花盆中放入约110 g提前处理好的（Reijerscamp）的土壤(如上所述)，并将幼苗转入其中，设置未种植拟南芥的土体土壤对照盆栽。使用镊子将在生长过程中由原始土壤带来的自然生长的其他幼苗拔除。每两周加一次½的Hoagland营养液，并浇水保持水分。

实验处理

Experimental treatments

三周后，对于不同处理我们或使用10⁴的Hpa菌悬液喷施接种到拟南芥叶片上，或Bc菌的的二分之一PDB培养液（孢子浓度：5×10⁵）滴加5微升滴加到真叶中心上。或使用0.015% (v/v) Silwet L - 77溶解1mMSA或100μMMeJA滴加到不同激素处理中。此处两种激素的浓度设置参照其激发对应激素信号通路的浓度。激素处理每4天重复添加一次激素，直到实验结束。接菌处理，间隔8天，接种一次病原菌，保证病原菌存活。盆栽被随机放置在一个人工气候室(21°C,相对湿度70%,10 h/14 h, 光强度100μmol m⁻² s⁻¹)。注意，在接种病原体后的72小时内，用透明的盖子盖住以增加湿度。 8天后，接种Hpa的植株叶片开始产生孢子，在第15天霜霉病症状表现为叶片严重发黄；而接种Bc的植株在叶片上发生损伤，损伤在第15天扩散到叶片边缘。

植物RNA提取及qRT-PCR分析

Plant RNA extraction and qRT-PCR analysis

RNA提取: 分别在处理开始后的1、3、5、7、9、11、13、15天，取每个处理4株植株的2片叶片，冷冻于液氮中用于从植物叶片中提取总RNA，用Ambion DNase I (ThermoFischer Scientific)处理。使用反转录试剂盒将总RNA转化为cDNA。采用ViiA 7实时荧光定量PCR系统进行两步qRT PCR，定量试剂使用：PowerSYBR绿色PCR反应混合液(ABI公司)加入10pmolμL⁻¹引物。反应条件:50℃为2分钟，95℃为10分钟，40个循环95℃为15秒，60℃为1分钟。
熔融曲线条件：在40个循环结束后，从60°到95°，按照梯度1°/min设置测定。内参基因使用的atlg13320，表达量的标准化使用之前的方法2^-△△CT进行计算。

微生物群落分析

Microbiome analysis

处理后的第8天和第15天，每个处理分别取16盆用来收集土体土壤（在盆栽中非根际土壤部分）和根际土壤(50-250 mg)，所取样品用于分析微生物群落。花盆里的泥土和植物都被小心地松翻，大部分的泥土都被轻轻地和根系分离，尽可能地保持根系完好无损。然后小心将根系提出，轻轻摇动，除去松散的粘着土壤。使用PowerSoil DNA Isolation Kit (Mobio)从160个附着土壤的根系和32个土体土壤样本中提取总DNA。微生物群落测定之前，将一个处理中4个重复DNA混为一个，每个处理准备四个重复。并使用PhyloChip 测定微生物群落（Second Genome Inc.美国旧金山)。PhyloChip简介：是一种基于探针的微生物群落分析的方法，可以测定超过60,000个微生物种类的相对丰度。将细菌和古细菌的16S rRNA基因拷贝杂交到PhyloChip G3的个探针上，探针上带有一定数量的非16SrRNA序列。测定荧光强度(FI)，定量扩增子与探针的杂化程度，并按比例scale到spiked-in定量标准。将完全匹配探针(PM)观察到的荧光强度与不匹配探针(MM)进行比较。其中有三个指标达标之后确定为阳性：PM/MM> 1.5；PM-MM>50*N；r>0.95，其中N为芯片特异性噪声，r为represents 得分。基于所有生物样本的FI相关性和分类相关性，将探针聚集成探针集。探针组定义的OTU(eOTU)由探针组中所有探针中9-mers的组合进行分类注释。计算每个eOTU和每个样本的平均log₂FI，称为杂交得分(HybScore)，并在之后的微生物种群丰度分析中使用。如果80%的探针呈阳性，则认为存在eOTUs。在一共检测到的379个eOTUs中，341个至少在一个样本中达到了这个阈值。采用XLSTAT 和 Excel(Microsoft)对所有生物样本中HybScore（丰度）最高的75%的eOTUs进行主成分分析。使用Phyloprofiler评估错误率。

• 译者想说：相比于二代测序，基于探针的微生物群落分析技术近年来使用的比较少，其中特异性的探针分辨率远小于目前基于常用的Illumina Hiseq或者Misep的测序技术，并且其特异性的探针想必会屏蔽部分新菌，但是这种技术是否具有测得OTU分辨率更高，使用eOTU更加方便进行后续的纯菌验证工作。

筛菌

Selection of bacterial isolates

在上述实验结束时，将感染Hpa的植株根际土壤放置于在1mL含25%甘油(v/v)的5 mM MgSO₄溶液中，并保存在-80℃环境中。根际土壤在室温下解冻，涡旋120s。为了最大限度地分离可培养的细菌种类，设置一下梯度稀释培养基:

• (1) 1/10浓度TSA;
• (2) TSA中添加10mg L^-1粘菌素;
• (3) TSA中添加5mg L^-1粘菌素和10mg L^-1 萘啶酸（naladixic acid）;
• (4) TSA中添加5gLL^-1N氯化钠和64mgLL^-1多粘菌素B;
• (5) TSA中添加5gL^-1 NaCl, 64mg L^-1 polymyxin B和10mg L^-1 庆大霉素;
• (6) Merck培养基合并water yeast agar培养基 (每升:5g NaCl, 1g KH₂PO₄, 0.1g酵母提取物(Difco)， 15g琼脂(Difco);
• (7) peptone yeast extract(每升:10g蛋白胨(Difco)， 2 g酵母提取物(Difco)， 2g NaCl, 2g MgSO₄·7H2O和15g琼脂(Difco);
• (8) R2A培养基;
• (9) 黄单胞菌选择性培养基;
• (10) 寡养单胞菌选择培养基;
• (11) King’s medium B 培养基加入13mg L ^-1氯霉素和40mg L ^-1氨苄青霉素。所有培养基用200mg L ^-1Delvocid进行改良（DSM：活性成分为纳他霉素（natamycin））。

备注：这些培养基详见原文参考文献；

所有平板均在在20℃培养 3 - 5天。一共选择288个形态不同的单菌落并在TSA上划线纯化。在1/10浓度TSB中接种纯培养的单菌落并摇菌，条件为：在20℃、180 rpm下培养过夜，液体加入25% (v/v)甘油保存在-80℃下。编号系统：WCS2014标记代表的意思为"Willie Commelin Scholten"和筛菌年份。

菌种鉴定及其特征

Identification and characterization of bacterial isolates

单菌落细菌菌体加入到20μL水中,在95°C条件下孵育15分钟, 然后立即在冰浴冷却。用水稀释10倍，离心(1min, 10000g)去除细胞碎片。用引物F27和R1492扩增16S rRNA基因。两微升菌体粗提液加入50μL PCR的反应体系中(5μL 10 Dreamtaq缓冲液, 1μL dNTP’s, 2.5μL 10μM的正反引物, 1μL Dreamtaq聚合酶,36μL H₂O。PCR反应条件:(仪器：Hybaid, Ashford, UK)==94℃：5min，随后在94℃时为1min,55 ℃时为1min,7 2℃时为1min循环30次，最后在72℃时延长10 min。PCR产物使用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测是否成功扩增。PCR产物由韩国首尔Macrogen公司进行测序。通过核糖体数据库的序列匹配菌株注释信息.

为了确定是否鉴定到了菌株水平以及其菌株之间的同源相似性，我们采用了BOX-PCR技术。使用试剂盒GenElute™
Bacterial Genomic DNA Kit (Sigma)按照说明书提取细菌基因组DNA。使用25μL反应体系，为：
1 μL DNA，0.5 μL 10mM
dNTPs, 0.25 μL 10 μM BOXA1R，0.125μL酶, 20.625μL H2O；PCR反应设置30个循环，条件为：95°C:7 min; 90°C：30 s ,95°C1 min； 52 °C :1min; 65°C:8min；65°C:16 min,循环30次。PCA产物使用琼脂糖凝胶电泳检测。

基因组测序和比较基因组分析

Genome sequencing and genetic comparison

采用Nextera XT试剂盒(Illumina, USA)制备了黄单胞菌WCS2014-23、寡营养单胞菌WCS2014-113和微杆菌sp. WCS2014-259全基因组测序文库，并采用Illumina MiSeq (Illumina, USA)进行测序。使用A5-MiSeq对双端reads进行质控、修剪和组装，组装好的基因组草图上传至Integrated Microbial Genomes
Expert Review系统进行基因注释。基因组数据上传至Joint Genome Institute genome portal(https://genome.jgi.doe.gov/); IMG基因组id分别为、和。使用MASH估计测序分离物与Refseq数据库序列的基因组的距离(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/)。

定量生物膜形成过程

Quantification of biofilm formation

根据Ren等人的方法，对所选细菌菌株形成的生物膜的量进行了定量。将黄单胞菌WCS2014-23、寡养单胞菌WCS2014-113、微杆菌sp. WCS2014-259分别接种于5ml TSB培养基中，20°C、180 rpm培养24 h。然后在590 nm处测定OD值 (OD 590)约0.5，随后使用TSB培养液稀释至0.15。随后转移到5 ml TSB中，在20 ℃ 180 rpm下再次培养过夜。培养好的菌液被单独加入或与其他菌液混合（等数量，总体积为160μL）加入到Nunc-TSP 96孔板子中。最终的细菌浓度在单独培养和混合培养体系中都是相等的。用Parafilm盖上，并在20 ℃静置培养孵育48 h。通过将peg盖子放到包含有200微升磷酸缓冲液中来去除未固定的细胞。随后使用180μL含水1%(W/V)的结晶紫对peg盖子上的生物膜进行染色（20分钟）。随用在PBS冲洗三次，使用200μL 96%乙醇孵育来释放被生物膜吸收的结晶紫。用分光光度计测定紫水晶的乙醇溶液的OD值（OD590），从而定量生物膜厚度.

菌株之间的相互影响

Attraction between colonies

将黄单胞菌WCS2014-23、寡养单胞菌WCS2014-113、微杆菌sp. WCS2014-259接种于5 mL King’s medium B培养基中，在20°C, 180 rpm条件下培养过夜。取出后再使用OD值（600nm），将菌液的OD值调整为0.1。使用排枪将1μL这些稀释液接种在倒有KB培养基方形培养皿的两侧的对角线上，接种七个点，随着细菌的生长呈现出V形。盖上盖子后20°C培养箱中培育15天。菌落直径测量与v形线垂直的方向距离。

抗利福平突变体的选择

Selection of rifampicin-resistant mutants

为了进一步明确三株菌在植株生长的促进过程，根据Glandorf等人的方法制作了黄单胞菌WCS2014-23、寡养单胞菌WCS2014-113和微杆菌sp. WCS2014-259的抗利福平突变株。这些菌转移到含有浓度梯度为100, 150, 200, 250μg/ml利福平的TSA培养基上。验证了突变体中利福平抗性的稳定性，并发现利福平抗性突变体的生长速度与野生型相似。

生长促进试验

Growth promotion assay

拟南芥添按上述方法栽培。两周后,幼苗被转移到60ml的盆中。盆中预混有假单胞菌 WCS417r(原名荧光假单胞WCS417r）, 或者上述三种突变株的一种或者组合菌株，无论哪个处理均将添加的菌密度调整为1×10⁸ cfu/g。土壤处理参见上文材料方法，菌液进行重悬去除培养基后再加入土壤。然后使用添加150μg mL⁻¹的利福平的KB培养基进行稀释涂布最终确定菌数量。在经过微生物处理的土壤中生长4周后，对6周龄的植株进行收获，并测定地上部分重量。

植物系统抗性评估

ISR assay

植物系统抗性评估实验采用的土壤及其植株同先前描述类似。植株对对霜霉病病原菌抗性的评估按照描述进行：使用用Hpa 接种生长5周的植株。起初培养时，盖上透明的盖子，以增加相对湿度。接种Hpa 6天后，测定Hpa孢子数。收集受感染植株的部位到加有3 mL H₂O的15 mL试管中，并涡旋30 s。随后，使用显微镜(Axioskope, Zeiss, Jena, Germany)对孢子进行计数，然后计算Hpa孢子数。以上实验重复多次。方差分析采用XLSTAT 和 Excel(Microsoft)。

被霜霉病感染后土壤遗产的形成

Soil-mediated legacy of downy mildew-infected plants

2016年6月，在Reijerscamp自然保护区从同一地点采集土壤，然后按照上述方法进行筛选、干燥和储存。80个60毫升的盆栽装满了大约110克的土壤，按田间持水量浇水。为了防止苔藓和藻类的生长，土壤表面覆盖了a circular plastic cut-out of micro
pipette tip holder (Greiner Bio-One, 0.5–10 μL, Item No.:
)。将拟南芥种子悬浮在0.2% (w/v)的琼脂溶液中，在4℃的黑暗环境中培养2天。将1-2粒种子分别放在花盆盖的每个孔，在40个花盆中播种约40粒种子其余40盆不做播种。盆栽放在小碟子上,并浇二分之一浓度的度霍格兰营养液,后随机放置在托盘的,并覆盖着透明的盖子转移到培养箱中(21度,相对湿度70%,10 h/ 14 h,光强：100μmol^-2 s^-1)。一周后，将透明盖子换成了网眼盖子，以降低盆钵中的湿度。两周后,将Hpa孢子悬浮液(50孢子μL^-1如上所述)或水喷施到不同处理中。托盘上再盖上透明的盖子，以增加湿度，感染一个星期。随后，将第一代植株的地上部分全部剪掉并移走，并在上述所有花盆上播种新种子。并重复第一代的管理和处理。然后，根据前文提到的方法，通过测定植株地上部Hpa孢子的数量来量化感染霜霉病的严重程度。

Reference

Roeland L. Berendsen, Gilles Vismans, Ke Yu, Yang Song, Ronnie de Jonge, Wilco P. Burgman, Mette Burmølle, Jakob Herschend, Peter A. H. M. Bakker & Corné M. J. Pieterse. Disease-induced assemblage of a plant-beneficial bacterial consortium. The ISME Journal. 2018, 12: 1496-1507. doi:10.1038/s41396-018-0093-1

Jun Yuan, Jun Zhao, Tao Wen, Mengli Zhao, Rong Li, Pim Goossens, Qiwei Huang, Yang Bai, Jorge M. Vivanco, George A. Kowalchuk, Roeland L. Berendsen & Qirong Shen. Root exudates drive the soil-borne legacy of aboveground pathogen infection. Microbiome. 2018, 6: 156. doi:10.1186/s40168-018-0537-x

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