酸水解蛋白质_酪蛋白水解物的功效

Introduction

心血管疾病(CVD)已成为全球死亡的首要原因，预计到2030年将导致超过2220万人死亡。血栓形成与3种主要心血管疾病高度相关，包含缺血性心脏病、脑卒中和静脉血栓栓塞症。此外，血栓形成在癌症患者的死亡发生率中起着关键作用。尽管临床上有抗凝药物，但大多数抗凝药物都表现出对健康的危害，并可产生出血。因此，探索更有效、更安全、副作用最小的抗凝药物越来越重要。

高血压不仅是心血管疾病的主要危险因素之一，还与肥胖等代谢综合征有关。血管紧张素I转换酶(ACE，EC 3.4.15.1)是控制血压重要的酶，因为ACE同时参与了激肽释放酶-激肽系统(KKS)和肾素-血管紧张素系统(RAS)。ACE将释放强效的血管紧张素Ⅱ，并使体内的缓激肽失活。与抗凝血药物类似，一些报道的ACE抑制剂也有一些副作用，包括咳嗽、皮疹和头晕。

酪蛋白是一种主要且安全的牛奶蛋白。酪蛋白肽具有多种生物活性，如抗炎、免疫调节、抗凝血、血管紧张素I转换酶抑制(ACEI)活性等。因此，酪蛋白肽是探索其抗凝血和ACE抑制作用的有前途的实体。此外，探索功能性膳食补充剂成分是面对全球CVD负担的有意义的策略。研究同时防治血栓和高血压的双功能食品是未来药用食品发展的新景象。

近来，生物信息学被广泛应用于生物活性功能化合物的筛选，以及多肽的筛选。利用定量结构—活性关系(QSAR)和分子对接来预测目标分子的活性。肽类化合物的基本性质可以通过在线工具进行分析。例如，Expasy-Compute pI/Mw(https://web.expasy.org/compute_pi/)、ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)、Pepdraw(http://www.tulane.edu/∼biochem/WW/PepDraw/)、ToxinPred(http://crdd.osdd.net/raghava/toxinpred/)等。

大连工业大学的Maolin Tu、Ming Du等在本研究旨在探讨酪蛋白水解物的抗凝血和ACEI活性，并确定潜在的酪蛋白生物活性肽。采用NanoLC-Q-TOF-MS/MS对酪蛋白肽进行测序。采用凝血酶时间(TT)、活化部分凝血酶时间(APTT)和高效液相色谱(HPLC)方法测定水解物的抗凝血和ACEI活性。采用体外法和计算机法联合分析了潜在的生物活性肽。

Results and Discussion

体外抗凝和ACE抑制活性

到目前为止，很少有研究表明蛋白质水解物和酪蛋白水解物同时具有抗凝血和ACEI的作用。在此，对经胃蛋白酶处理的酪蛋白水解物的抗凝和ACEI活性进行了评价。如图1A和1B所示，酪蛋白水解物表现出显著的抗凝活性。TT测定表明，酪蛋白水解物浓度越高，凝血时间越长。酪蛋白水解物在浓度为10 mg/mL时，凝血酶凝固时间延长约1倍。APTT测定结果表明，酪蛋白水解物也具有延长APTT的能力。与TT测定相似，在20 mg/mL浓度下，酪蛋白水解物与对照组相比，APTT增加了3倍。TT延长意味着凝血酶活性或纤维蛋白聚合受到抑制。APTT的延长意味着共同和/或内在途径被抑制。与之前的研究所报道的牡蛎(Crassostrea gigas)肽的TT和APTT测定相比，酪蛋白似乎是抗凝血肽更合适的选择。此外，酪蛋白水解物的抗凝效果强于已报道的抗凝酪蛋白肽YQEPVLGPVR和乳铁蛋白肽LRPVAAEIY，说明酪蛋白水解物中可能存在一些具有高抗凝活性的肽，值得进一步分析。

A. TT测定；B. APTT测定。

图1 酪蛋白水解物的体外抗凝活性

除了酪蛋白水解物的抗凝血活性外，图2表明，酪蛋白水解物具有很强的ACEI活性能力，IC50值为1.775 mg/mL。这些数据表明，胃蛋白酶处理后，酪蛋白中释放了一些ACEI肽。为了找出酪蛋白水解物中的哪种成分是造成这种效果的原因，进行了NanoLC-Q-TOF-MS/MS分析，并利用Mascot服务器保证了酪蛋白肽的含量。共鉴定出115个肽段，其中来自αs1-、αs2-、β-和κ-CN的肽段分别为34、9、55和17个。此外，进一步分析表明，酪蛋白水解物中含有ACEI肽，YQEPVLGPVRGPFPIIV和YQKFPQY。同时，从水解物中鉴定出5种抗菌肽：VQVTSTAV、SDIPNPIGSENSEK、RPKHPIKHQGLPQEVLNENLLRF、KTVYQHQKAMKPWIQPKTKVIPYVRYL，以及VYQHQKAMKPWIQPKTKVIPYVRYL。在体内消化0.5 h后，从小鼠胃中也鉴定出了多肽FRQFYQL和NLHLPLPLL。根据图3显示，鉴定出的多肽由7～47个氨基酸组成。

图2 酪蛋白水解产物的ACEI活性

A.酪蛋白肽的肽长度分布；B.酪蛋白肽的分子量分布。

图3 酪蛋白水解物中鉴定出的酪蛋白肽

鉴定出的生物活性肽的可能机制和理化特性

本研究结果表明，酪蛋白水解物具有较高的抗凝血和ACEI活性。然而，从水解物中完全鉴定出115种肽，可以使用计算方法筛选出潜在的生物活性肽。

由于大多数ACEI肽含有不超过10个氨基酸，为了节省时间和成本，考虑使用≤10个氨基酸的酪蛋白肽。采用PeptideRanker(http://distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/)对每个肽进行评分，评价肽的生物活性概率。在本研究中，选择PeptideRanker得分高于0.5的肽进行进一步研究。PeptideRanker得分大于0.5且氨基酸残基数小于11个的肽有9个。此外，通过PepSite 2服务器分析了多肽与ACE/凝血酶之间的相互作用。表1显示，9种肽(FRQFYQL、NENLLRF、VLNENLLRF、NPWDQVKR、NLHLPLPLL、PVVPPFLQ、PVRGPFPIIV、SRYPSYGLN和ARHPHPHLSF)与ACE有强效相互作用，Pepsite 2的P＜0.05。肽ARHPHPHLSF产生的P值最低(2.509×10-5)。相似性方面，6种肽(FRQFYQL、NENLLRF、NPWDQVKR、PVVPPFLQ、PVRGPFPIIV和ARHPHPHLSF)与凝血酶有强效相互作用，Pepsite 2的P＜0.05，其中FRQFYQL呈现的P值最低(0.002834)。因此，这6个肽可能同时具有ACEI和抗凝血活性。多项研究表明，酪蛋白肽的电荷和疏水性将影响其生物特性，如跨上皮运输和生物利用度。这些结果为研究具有抗凝血和ACEI活性的生物活性肽提供了理论和实践意义。

表1 使用PepSite 2分析生物活性肽和ACE之间的潜在结合位点

Conclusion

本研究对胃蛋白酶消化后释放的酪蛋白水解物的生物活性和多肽谱进行了评价。通过NanoLC-Q-TOF-MS/MS对酪蛋白水解物中的115种肽进行了鉴定。6种肽类同时显示出抗凝血和ACEI活性，并采用计算机方法进行分析。该研究表明，酪蛋白水解物中存在双功能肽，是一种很有前景的功能性食品补充剂。

In vitro and in silico analysis of dual-function peptides derived from casein hydrolysate

Maolin Tu, Xinyu Qiao, Cong Wang, Hanxiong Liu, Shuzhen Cheng, Zhe Xu, Ming Du*

School of Food Science and Technology, National Engineering Research Center of Seafood, Collaborative Innovation Center of Seafood Deep Processing, Dalian Polytechnic University, Dalian , China

*Corresponding author.

E-mail address: duming@dlpu.edu.cn

Abstract

There is no study on food-derived peptide with both anticoagulant and angiotensin I-converting enzyme inhibitory (ACEI) activities yet. In this work, the anticoagulant and ACEI activities of the casein hydrolysates released by pepsin digestion were evaluated for the first time to the best of our knowledge. Results indicated that the casein hydrolysate exhibited potent anticoagulant activity by prolonging the thrombin time (TT) and the activated partial thromboplastin time (APTT). Compared with control samples, at 10 mg/mL, the TT and APTT of casein hydrolysate were 186.0 % ± 6.6 % and 163.5 % ± 7.4 %, respectively. The casein hydrolysate also showed a strong ACEI activity with an IC50 value of 1.775 mg/mL. The components of the bioactive casein hydrolysate were analyzed by nanoscale liquid chromatography quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry (NanoLC-Q-TOF-MS/MS). Total of 115 peptides were identified, among which 34, 9, 55 and 17 peptides were derived from αs1-、αs2-、β- and κ-CN, respectively. The results of PeptideRanker and PepSite 2 analysis showed that 6 peptides (FRQFYQL, NENLLRF, NPWDQVKR, PVVVPPFLQ, PVRGPFPIIV, and ARHPHPHLSF) have both ACEI and anticoagulant activities by binding to the active sites of ACE and thrombin. This study indicated that casein is a potential functional food supplement that can be used for medical purposes.

该文章《In vitro and in silico analysis of dual-function peptides derived from casein hydrolysate》发表于Food Science and Human Wellness 2021年第1期32-37页。点击下方阅读原文即可查看摘要原文。

翻译：梁安琪；编辑：袁艺；责编：张睿梅

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