蛋白质定向进化策略
参考：
http://www.pibb.ac.cn/html/2015/2/20140059.htm
定义
蛋白质定向进化的本质是构建分子多样性文库 以及从文库中筛选到性状有改进的突变体，根据 文库构建原理的不同，可分为随机进化、半理性进 化和理性进化三种策略，其大致思路均为由某一靶基因或一族相关的家族基因起始，通过对编码基因 进行突变或重组，创建分子多样性文库；筛选文库 获得能够编码改进性状的基因，作为下一轮进化的 模板；在短时间内完成自然界中需要成千上万年的进化，从而获得具有改进功能或全新功能的蛋白质。
随机进化
随机进化方法
- 体外随机进化
- 非重组的体外随机进化
- 基于重组的体外随机进化
- 基于重组的体内随机进化
基于重组的体外随机进化
不同随机进化的基本技术流程
(a) 易错PCR，改变PCR反应条件，产生随机突变.
(b) 点饱和突变，将模板DNA的特定位点突变为所有20 种氨基酸.
© DNA重组，将一 组同源基因用核酸酶消化，得到的随机产物互为引物和模板进行PCR 扩增，当来源不同的片段之间相互形成模板时，即发生重组.
(d) 串联重复插入，将一组基因用CircLigase 消化，再使用连接酶将其连接成环，并以此作为模板进行PCR反应，不同的串联重复序列发生随机 连接，得到目的文库.
基于重组的体内随机进化
作用
体内重组方法则能够平行操作多个基因，同时进化代谢网络中的多个关键蛋白酶，从而在短时间内获得表型优良的突变株。（能对代谢途径或网络进行操作）
多元基因组工程 (multiplex automated genome engineering,MAGE)
能够对多个基因进行修饰，达到进化代谢途径甚至 整个细胞性能的目的．MAGE 基于ssDNA 同源重组的原理，将合成的ssDNA 导入细胞并定位在染色体的特定位点，使得到的每个细胞都含有一组不同的突变，重复进行此过程可以快速且连续地获得丰富的序列多样性异质群，最后鉴定细胞基因型和表型．优化条件后，使用MAGE 技术可在2～2.5 h 内对目标细胞群体引入至少30%的基因修饰．
- 应用实例
Harris等用长度为90-mer 的核糖体结合位点(RBS) 文库(DDRRRRRDDDD；D=A，G，T；R=A，G) 对1- 脱氧-D- 木酮糖-5- 磷酸还原异构酶合成途径 (DXP 合成途径)中20 种基因的RBS 区域进行置 换，优化不同基因的表达水平．同时，为提高 DXP 合成途径通量，将其溢流代谢途径中4 个基 因(ytjC、fdhF、aceE、gdhA)的开放阅读框(ORF)分 别引入了两个无义突变．经过35 轮MAGE 循环， 从多达150亿种突变体文库中筛选到了将番茄红素 的产能提高5 倍的突变株．
多元质粒工程(multiplex iterative plasmid engineering，MIPE)技术
参考 MAGE 技术的原理，以单链ssDNA 介导的λ-red 重组，可以同时修改质粒上的多个位点．通过酶切 共筛选技术，提高了多片段重组效率，6 bp 的酶切 位点可以被反复利用，无限循环．MIPE 技术的突 变过程和筛选过程严格分开，这使它能够应用到没 有高效重组系统的宿主中．我们利用MIPE技术对 红色荧光蛋白(red fluorescent protein，RFP)上的7 个关键位点进行突变，仅用3 天时间，获得了不同 光谱特性和不同光强的RFP 突变体，这显示了 MIPE 技术在蛋白质定向进化中的巨大应用潜力．
半理性进化
概念
半理性进化 (semi-rational evolution)策略则借助了生物信息学方 法，在分析大量的蛋白质序列比对信息，二级结构数据，甚或是在同源建模得到目的蛋白三维空间构象的基础上更有针对性地对蛋白质进行改造，不但提高了阳性突变率，而且大大缩小了突变文库容量，更易于筛选．
方法
- 通过计算机模拟获得潜在的有益突变位点
- 利用适当的饱和突变技术构建合适的突变文库
- 不同的计算机算法以及结构分析方法．此外，对于结构较为复杂的蛋白质，可将其分为不同的结构单元，并在其内部独立进化，组合筛选最佳进化单元，得到完整蛋白质．
计算机算法
- 基于三维结构或同源建模分析
- 突变位点获得：SCHEMA、HotSpot Wizard、ProSAR
- 文库构建方法：GSSM、ISM、CASTing
- 改进性质：对映选择性、热稳定性、底物特异性
- 基于性质
突变位点获得：QSAR、ASRA
3.基于结构分析
- 突变位点获得：SCOPE
- 文库构建方法：外显子重排
- 改进性质：配合基-受体
理性进化
概念
理性进化策略主要是在计算机中(in silico)完成．通过计算机建模(computational modeling)预 测蛋白质活性位点，考察某基因突变对目标蛋白稳定性、折叠以及与底物结合的影响，从而对蛋白质进化进行设计指导和模拟筛选实验，提高实验的成功率．
步骤
- 从头设计则能够对这些因素加以考虑．从头设计首先根据量子力学建模得到目的催化反应
- 额外考虑某个具有高能垒的反应，推测其过渡态，定位所需的催化侧链并结合反应的优化过渡态
- 利用QM/MM模型分析得到包含过渡态和涉及结合、催化的蛋白质功能团的理论蛋白质突变文库，再利用Rosetta、ORBIT、PyMol 等软件，在大量稳定的蛋白支架中搜索能够支持这些理 想活性位点的蛋白质主链群，最终经过优化处理的基因序列即可进行实验验证
- 这种方法能够在数 百个潜在的模板酶侧链中自动挑选合适的算法搜索催化侧链过渡态，并将其定位到合适位置
意义
从头设计对于酶进化轨迹的分析有助于增强人 们对蛋白质自然进化的理解，从实验中获得的反馈信息也可以更好地辅助完善理性设计．此外，利用计算机预测可以建立代谢途径、分析代谢网络，从而使用工程学方法选出重要的酶加以进化，以达到整个途径或网络的优化目的．
蛋白质定向进化文库的筛选策略
- 表型观察的筛选
- 噬菌体表面展示(phage display)
- 酵母表面展示(yeast surface display)
- 流式细胞分选技术(flowcytometer, FCM)
表型观察的筛选
通过对细胞的生长率、生存率或底物消耗、产物生成速 率等的观测筛选出目的菌株，例如琼脂平板克隆筛 选或粗酶裂解液的酶活检测等方法
噬菌体表面展示(phage display)
酵母表面展示(yeast surface display)
将表达的多肽以融合蛋白形式 展现在核糖体、病毒或细胞表面，并使其保持相对 独立的空间结构和生物活性，借以研究多肽的性 质、相互识别和作用，筛选特定功能的多肽结构， 实现蛋白质的定向进化
流式细胞分选技术(flowcytometer, FCM)
流式细胞分选技术能够实 现单细胞的依次高速通过激光聚焦监测点，经激发 光激发后产生荧光信号，根据光信号的变化来判断 该细胞的大小、形态以及荧光强度，并可以将需要 得到的细胞亚群从中分选出来．（微流控技术(droplet microfluidic technology)）
蛋白质定向进化的应用
改善酶催化效率
- 提高酶活性
- 解除抑制作用（残基进行点突变）
提高酶稳定性
- pH 值的稳定性
- 热稳定性
